Ernst Herzfeld wurde am 23. Juli 1879 als Sohn eines Militärarztes der preußischen Armee in Celle geboren.
Nach dem Abitur 1897 begann er nach Absolvierung eines einjährigen Militärdienstes mit dem Studium der Architektur an den Technischen Hochschulen Berlin und München. Des weiteren studierte er an der Friedrich-Wilhelm-Universität in Berlin bei Friedrich Delitzsch Assyriologie sowie Kunstgeschichte und Alte Geschichte.
1903 beendete er sein Architekturstudium mit dem Staatsexamen, anschließend verpflichtete er sich für zwei Jahre zur Teilnahme an den deutschen Ausgrabungen in Assur unter der Leitung von Walter Andrae. Einen Aufenthalt in Baghdad während der Assur-Grabungen benutzte Herzfeld zu ersten Inspektionen in Samarra.
1905 und 1906 führten ihn Reisen durch Mesopotamien und Persien, auf denen sein besonderes Interesse den archäologischen Stätten Samarra, Ktesiphon, Persepolis und Pasargadae galt. Während dieser Reisen dokumentierte er die für ihn wichtigen achäologischen Zeugnisse in Zeichnungen, Photographien und maßgerechten Aufnahmen.
1907 promovierte er mit der Dissertation „Pasargadae. Aufnahmen und Untersuchungen zur Persichen Archäologie“ bei Eduart Meyer – nicht mit einem Thema der Alten Geschichte. Neben einem Beitrag über die historische Topographie mesopotamischer Landschaften erschienen 1907 „Samarra. Aufnahmen und Untersuchungen zur islamischen Archäologie“ und „Bericht über eine Reise durch Luristan, Arabistan und Fars“. Bereits diese Arbeiten zeigen das breite Interessengebiet des Autors und sein stetes Zurückgreifen auf Schriftquellenmaterial. Seine Forschungstätigkeit umfaßt Perioden des Alten Orients vom dritten Jahrtausend v. Chr. bis zu den Achämeniden und bis in die islamischen Jahrhunderte.
Wieder schlossen sich ausgedehnte Reisen in Syrien und im Iraq an, diesmal in Begleitung von Friedrich Sarre, dem damaligen Direktor des Islamischen Museums in Berlin.
1909 hat er sich mit dem Thema über iranische Felsreliefs habilitiert, eine Arbeit, die 1919 veröffentlicht wurde.
1911 begann Ernst Herzfeld mit den unter seiner Leitung stehenden Ausgrabungen in Samarra, die bis 1913 fortgeführt wurden und die nicht nur seinen Ruhm als Forscher und Ausgräber begründeten, sondern ihn auch als Mitbegründer der islamischen Archäologie und Kunstgeschichte werden ließen. Gleichzeitig waren seine Forschungen in Samarra die ersten Ausgrabungen in einem Ruinengebiet der islamischen Zeit in der östlichen Welt.1917 erhielt Herzfeld das Extraordinariat für „Orientalische Hilfswissenschaften“ an der Universität Berlin.
Seit 1920 war er schließlich Ordentlicher Professor für Archäologie des Nahen Ostens, das erste Lehrfach seiner Art weltweit, das dann in ein Institut für „Landes- und Altertumskunde des Orients“ umgewandelt wurde. Daneben spielten seine Feldforschungen und Ausgrabungen eine gravierende Rolle, ab 1923 hielt er sich fast laufend zu Forschungszwecken in Persien auf und unternahm erste Sondagen in Pasargadae. Nach dem Ersten Weltkrieg war es ihm 1923 bereits wieder möglich in den Iraq zu reisen. 1923/24 folgten Aufnahmen der Ruinen von Persepolis.
In diese Zeit fallen Lehrtätigkeiten in Teheran (1927). Ab 1926 ist er Berater der persischen Regierung.
1928 begann er mit der Planung und Einrichtung des „Archäologischen Instituts des Deutschen Reiches“ in Isfahan/Iran, das jedoch aufgrund der Weltwirtschaftskrise und den dadurch entstandenen finanziellen Engpässen nicht zur gewünschten Entfaltung kam.
An dem 1931 vom Iranischen Staat verabschiedeten Gesetzen zum Schutze der Altertümer war Ernst-Herzfeld maßgeblich durch Vorschläge und Ausarbeitungen beteiligt.
Von 1931 bis 34 war Herzfeld Direktor der Persipolis-Expeditionen.
Als er 1934 Teheran nach langenjährigem Aufenthalt verließ, kehrte er verständlicherweise nicht nach Berlin zurück, sondern wechselte nach London, wo er an der dortigen Univesität lehrte.
1935 wurde er von der Nationalsozialistischen Regierung aus politischen Gründen zwangsemeritiert.
1936 übersiedelte er nach Boston, wurde Mitglied des „Princeton Institute for Advanced Study“ und hielt dort Vorlesungen bis zu seiner Emeritierung 1944.
Kurze Zeit später zog es ihn wieder in den Orient, er wandte sich der islamischen Architektur zu, zunächst in Syrien, später in Ägypten. Während dieser Auslandaufenthalte erkrankte er in Kairo und ging zur medizinischen Behandlung in die Schweiz. Dortselbst starb Ernst Herzfeld am 20. Januar 1948 im Alter von 69 Jahren.